徠卡 DM2500 熒光顯微鏡細(xì)胞染色觀(guān)察

一、徠卡 DM2500 熒光顯微鏡核心配置與技術(shù)優(yōu)勢(shì)

• 光源類(lèi)型：

• 藍(lán)光通道（BP450-490，適合 FITC、GFP，發(fā)射光 515-550nm）；

• 綠光通道（BP510-550，適合 TRITC、Texas Red，發(fā)射光 590nm 長(zhǎng)通）；

• 紫外通道（BP330-385，適合 DAPI、Hoechst，發(fā)射光 420nm 長(zhǎng)通）。

• 標(biāo)配 100W 汞燈（適合 DAPI、FITC、TRITC 等常規(guī)熒光染料），可選配 LED 固態(tài)光源（壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性高）。

• 濾光片組（Cube）：

• 物鏡兼容性：

• 高數(shù)值孔徑（NA）物鏡（如 Plan Apo 40×/0.95，油鏡 100×/1.3），減少熒光信號(hào)損失。

二、細(xì)胞染色樣本制備與熒光標(biāo)記策略

（一）樣本固定與透化

1. 固定方法

• 醛類(lèi)固定：4% 多聚甲醛（室溫 10-15min），保持細(xì)胞形態(tài)，適合膜蛋白標(biāo)記；

• 甲醇 / 丙酮固定（-20℃，5min），增強(qiáng)膜通透性，適合胞內(nèi)抗原（如細(xì)胞骨架）。

2. 透化處理

• 0.1% Triton X-100/PBS（室溫 5min），破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，便于抗體或染料進(jìn)入胞內(nèi)。

（二）熒光染色方案（按靶標(biāo)分類(lèi)）

三、DM2500 熒光觀(guān)察操作流程與參數(shù)優(yōu)化

（一）顯微鏡啟動(dòng)與光路調(diào)節(jié)

1. 光源預(yù)熱與濾光片切換

• 汞燈需預(yù)熱 10-15min 至穩(wěn)定，避免頻繁開(kāi)關(guān)（影響壽命）；

• 根據(jù)染料選擇對(duì)應(yīng)濾光片組，通過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)切換（如觀(guān)察 DAPI 時(shí)插入 UV Cube）。

2. ** K?hler 照明調(diào)節(jié) **

• 調(diào)節(jié)聚光鏡光闌（縮小至 1/2 視野），調(diào)中聚光鏡后擴(kuò)大光闌，確保光斑均勻覆蓋視野。

（二）熒光觀(guān)察步驟

1. 低倍鏡定位與高倍鏡切換

• 先用明場(chǎng)（10× 物鏡）找到細(xì)胞區(qū)域，標(biāo)記后切換至對(duì)應(yīng)熒光通道；

• 切換高倍鏡（40×/100×）時(shí)，滴加鏡油（油鏡），緩慢調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至圖像清晰。

2. 曝光與信號(hào)采集

• 調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度（通過(guò) ND 濾光片，10%-50% 即可），避免強(qiáng)激發(fā)導(dǎo)致熒光淬滅；

• 相機(jī)曝光時(shí)間：DAPI 約 50-100ms，F(xiàn)ITC 約 100-300ms，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱微調(diào)（避免過(guò)曝產(chǎn)生偽影）。

（三）防淬滅與背景控制

• 封片優(yōu)化：

• 用含抗淬滅劑的封片劑（如 Vectashield），蓋玻片四周用指甲油密封，減少熒光衰減；

• 背景抑制：

• 樣本洗滌：PBS 洗 3 次，每次 5min，去除未結(jié)合染料；

• 自發(fā)熒光排除：用陰性對(duì)照（未染色細(xì)胞）確定背景熒光水平。

四、熒光圖像采集與分析要點(diǎn)

1. 拍攝參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化

• 統(tǒng)一放大倍數(shù)、曝光時(shí)間、增益（Gain），便于組間對(duì)比；

• 多通道成像時(shí)，采用 “順序掃描"（先拍短波長(zhǎng)再拍長(zhǎng)波長(zhǎng)），避免串色（如 DAPI 激發(fā)光干擾 FITC 信號(hào)）。

2. 定量分析指標(biāo)

• 熒光強(qiáng)度：用 ImageJ 軟件測(cè)量平均熒光密度（Integrated Density），排除背景值；

• 共定位分析：通過(guò) Pearson 系數(shù)（0-1）量化兩種熒光信號(hào)的重疊程度；

• 細(xì)胞計(jì)數(shù)：結(jié)合 DAPI 核染色，自動(dòng)計(jì)數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量（需設(shè)置合適閾值）。

3. 動(dòng)態(tài)觀(guān)察（活細(xì)胞）

• 配置加熱臺(tái)（37℃）和 CO?培養(yǎng)箱，維持細(xì)胞活性；

• 采用間隔拍攝（如每 5min 一次），記錄熒光蛋白（如 GFP）的動(dòng)態(tài)分布。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

六、延伸技術(shù)：DM2500 熒光顯微鏡的進(jìn)階應(yīng)用

• FISH（熒光原位雜交）：

• 用于基因定位（如染色體熒光標(biāo)記），需搭配紫外通道觀(guān)察探針信號(hào)；

• 免疫熒光共染色：

• 結(jié)合兩種以上抗體（如 α-tubulin-FITC + γ-H2AX-TRITC），研究 DNA 損傷與微管關(guān)系；

• 光漂白恢復(fù)（FRAP）：

• 通過(guò)高強(qiáng)度激光漂白局部熒光，利用 DM2500 的高靈敏度相機(jī)記錄熒光恢復(fù)速率，分析蛋白流動(dòng)性。

七、安全操作與設(shè)備維護(hù)

• 光源防護(hù)：

• 汞燈開(kāi)啟時(shí)避免直視光源，佩戴紫外防護(hù)眼鏡；

• 染料安全：

• 熒光染料（如 DAPI、PI）具潛在毒性，操作時(shí)戴手套，廢棄物按生物危害處理；

• 日常維護(hù)：

• 每周用無(wú)塵布清潔載物臺(tái)和物鏡，每月檢查濾光片組是否有灰塵（影響光透過(guò)率）。